La tecnologia NGS applicata allo studio delle matrici biologiche: i vaccini In evidenza

Vaccini NGSCome è ben noto, i vaccini sono farmaci biologici utilizzati per la prevenzione di alcune malattie infettive che contengono un principio attivo: gli “antigeni” (virus, batteri inattivati o attenuati, tossine inattivate, proteine o molecole complesse derivati dai virus e batteri), e altri componenti quali, gli adiuvanti (sostanze che aumentano la capacità degli antigeni vaccinali di indurre la risposta immunitaria anticorpale), gli eccipienti (sostanze necessarie per formulare il vaccino, o per preservarlo dalle contaminazioni batteriche) ed impurezze inevitabilmente presenti (sostanze presenti in tracce provenienti dalle materie prime, es. linee cellulari per la crescita dei batteri e virus, o dal processo di lavorazione, es. formaldeide, antibiotici ecc., contaminazioni).

di Loretta Bolgan*

*Dottore in chimica e tecnologie farmaceutiche, con dottorato in scienze farmaceutiche ad Harvard medical school Boston. Ha lavorato nel settore dell’industria farmaceutica dove si è occupata di registrazione e sviluppo di progetti di ricerca in ambito oncologico. Consulente di parte legge 210/92, inquinamento ambientale e malattie professionali, ha partecipato all’ultima Commissione parlamentare d’inchiesta sull’uranio impoverito nel gruppo vaccini. Attuale consulente per l’Ordine Nazionale dei Biologi per la tossicologia dei farmaci e dei vaccini, si occupa anche di nutrizione e terapie complementari.

Vari studi in letteratura hanno posto il problema della sicurezza dei componenti dei vaccini, soprattutto delle impurezze e delle contaminazioni sia di tipo chimico che biologico che potrebbero essere presenti nel prodotto finito; tuttavia, al momento non ci sono ancora studi conclusivi sulla loro tossicità. In particolare, i sali di alluminio, in quantità variabile tra 0,25 e 1,25 mg, non sono al momento eliminabili dai vaccini perché giocano un ruolo fondamentale nella risposta immunitaria. Riguardo la loro tossicità, l’Organizzazione Mondiale della Sanità (World Health Organization) sostiene che nella popolazione generale non esiste alcun rischio sanitario in relazione all’assunzione di alluminio con le vaccinazioni, i farmaci e con l’alimentazione (ogni giorno infatti ingeriamo con il cibo dai 5 ai 20 mg di alluminio, però solo una piccola parte della quantità di alluminio ingerita va in circolo e poi viene eliminata per via renale), tuttavia sono state evidenziate associazioni tra elevati livelli di alluminio in alcune preparazioni alimentari per neonati e nelle soluzioni per la nutrizione parenterale domiciliare con possibili complicanze neurologiche e ossee, caratterizzate da una riduzione della velocità di sintesi ossea, che pongono un serio dubbio sulla sicurezza dell’uso di questo adiuvante.
Un’altra sostanza utilizzata come agente inattivante per la preparazione di alcuni vaccini è la formaldeide (denatura una tossina batterica trasformandola in tossoide, cioè una proteina che ha perso la tossicità originaria ma ha mantenuto la capacità di stimolare il sistema immunitario) e pertanto può essere presente in tracce nel prodotto finito. Nonostante si tratti di quantità molto ridotte, sono stati sollevati dubbi sulla sicurezza di tale impurezza, perché è noto che alte concentrazioni di formaldeide possono danneggiare il DNA e determinare mutazioni genetiche in colture di cellule. Va detto che il nostro organismo produce naturalmente piccole quantità di formaldeide (questa sostanza fa parte del nostro normale metabolismo ed è necessaria per la produzione del DNA e di alcuni aminoacidi), ma tale produzione fisiologica non può essere ritenuta analoga alla sua introduzione per via iniettiva, motivo per cui è necessario ottenere maggiori dati sulla tossicità per via iniettiva di questa sostanza nell’uomo e soprattutto nei neonati.
Questi sono due esempi significativi dell’evidenza che gli studi sulla tossicità dei singoli componenti dei vaccini e sulla sinergia tra i vari componenti, sono ancora incompleti o del tutto assenti, soprattutto quelli riguardanti le impurezze e le contaminazioni, motivo per cui tutti gli studi e le ricerche che ci possono permettere di ottenere maggiori informazioni sulla qualità del prodotto finito e sulla sua sicurezza, oltre che sull’efficacia, vanno stimolati e divulgati.

In quest’ottica, il Corvelva ha intrapreso lo studio dei componenti dei vaccini e in particolare delle impurezze biologiche (materiale genetico estraneo), chimiche e proteiche che possono provenire dal processo di produzione, o possono essere presenti come contaminanti nelle colture cellulari o nelle materie prime.
I primi dati pubblicati recentemente riguardano la presenza di materiale genetico in alcuni vaccini di attuale commercializzazione, analizzati mediante NGS (Next Generation Sequencing, noto anche come deep sequencing), una tecnologia di sequenziamento ampiamente utilizzata dalla comunità scientifica per lo studio della composizione biologica, in termini di acidi nucleici (cioè DNA ed RNA), presenti in matrici complesse di diversa origine, secondo un approccio che viene definito “metagenomica”. L’analisi bioinformatica successiva consente poi la differenziazione tra l’origine dei frammenti di sequenza, come ad esempio animale, vegetale, batterica o virale fornendo anche una informazione di carattere quantitativo. Questo significa che campioni biologici misti possono essere agevolmente risolti con la tecnologia NGS, ormai entrata nella routine della ricerca genomica e tra le tecnologie d’avanguardia per la diagnostica.
Ad esempio la tecnologia NGS è utilizzata in ricerca e diagnostica umana per l’analisi delle feci con lo scopo di ricostruire l’intero microbiota, cioè la componente batterica, fungina e virale del microbioma intestinale, come descritto già nel 2010 in un articolo pubblicato su Nature dal titolo “A human gut microbial gene catalogue established by metagenomic sequencing”. Inoltre da dati NGS è possibile ricostruire l’intera sequenza di genomi virali a DNA e RNA e di genomi batterici presenti in un campione biologico e confrontarlo con i genomi di riferimento presenti nei database pubblici come descritto ad esempio per i virus in “Recent advances in inferring viral diversity from high-throughput sequencing data”.
Nel recente articolo prepubblicato su F1000researchDo you cov me? Effect of coverage reduction on species identification and genome reconstruction in complex biological matrices by metagenome shotgun high-throughput sequencing” la tecnologia NGS è stata utilizzata per analizzare matrici biologiche di diverso tipo, tra cui anche due lotti di un vaccino morbillo-parotite-rosolia-varicella, con lo scopo di dimostrare come, anche da un sequenziamento NGS a bassa copertura (cioè di qualche centinaio di migliaia di frammenti di sequenza a 1 milione), sia possibile caratterizzare la componente biologica in una matrice complessa. Il next-generation sequencing è stato già utilizzato su campioni vaccinali nella pubblicazione “Deep sequencing reveals persistence of cell‑associated mumps vaccine virus in chronic encephalitis” per dimostrare la coincidenza tra il genoma del virus vaccinale della parotite e il virus ritrovato nel tessuto cerebrale di un bambino di 18 mesi affetto da SCID, deceduto per encefalite.

In particolare, nell’articolo prepubblicato su F1000research, si osserva come circa l’80% delle sequenze ottenute con tecnologia NGS sui due campioni vaccinali, sia costituita da DNA umano, quale impurezza presente nel processo di lavorazione (dai certificati di analisi pubblicati nel sito del Corvelva risulta che la quantità di DNA totale estraneo è di circa 2 microgrammi, proveniente dalla linea cellulare fetale umana MRC-5 utilizzata per fare crescere i virus della rosolia e della varicella). L’analisi metagenomica eseguita su questi due campioni evidenzia la potenziale presenza di DNA umano in tutti i vaccini contenenti virus cresciuti in linee fetali umane, peraltro già verificata con tecnologia diversa dall’NGS anche dalla dr.ssa Theresa Deisher in “Epidemiologic and Molecular Relationship Between Vaccine Manufacture and Autism Spectrum Disorder Prevalence”.

Vaccini NGS1

B1 e B2 sono i due campioni di lotti diversi di vaccino MPRV analizzati: come si può vedere in B1 la % di DNA umano fetale proveniente dalla linea cellulare MRC-5 è dell’88%, mentre in B2 è del 74%, ma c’è anche la presenza di un 4% di DNA di pollo, derivante dalle cellule embrionali di pollo utilizzate per la coltivazione del virus del morbillo.

B1 e B2 sono i due campioni di lotti diversi di vaccino MPRV analizzati: come si può vedere in B1 la % di DNA umano fetale proveniente dalla linea cellulare MRC-5 è dell’88%, mentre in B2 è del 74%, ma c’è anche la presenza di un 4% di DNA di pollo, derivante dalle cellule embrionali di pollo utilizzate per la coltivazione del virus del morbillo.

Il gruppo della dr.ssa Deisher nell’articolo “Insertional mutagenesis and autoimmunity induced disease caused by human fetal and retroviral residual toxins in vaccines” afferma che i livelli di DNA residuo nei vaccini MPR, varicella ed epatite A disponibili negli Stati Uniti superano abbondantemente il limite previsto nell’attuale linea Guida OMS per il DNA proveniente da linee cellulari immortalizzate di 10 ng per dose di vaccino. Sebbene la linea guida EMA non preveda dei limiti massimi per il DNA fetale residuo nei vaccini, il gruppo della prof.ssa Deisher ha preso ugualmente come riferimento la dose massima di 10 ng in conseguenza del fatto che i frammenti corti di DNA fetale presente nei vaccini presentano la capacità di integrarsi nel DNA dell’ospite e possono portare a mutagenesi e/o instabilità genomica così come una risposta autoimmune. Inoltre, è stata riscontrata in alcuni vaccini contro la varicella ed MPR la presenza di frammenti del Retrovirus umano endogeno K (HERV K), il quale può essere ri-attivabile e può facilitare l’integrazione del DNA libero nel genoma dell’ospite.
Come affermato dalla dr.ssa Deisher, la pericolosità dei frammenti retrovirali e del DNA diploide umano residuo non è stata ancora studiata nei destinatari del vaccino, sebbene la letteratura scientifica dimostri chiaramente l’alta probabilità di pericoli di mutagenesi autoimmune e/o inserzionale dovuta alla presenza di questi residui, e questo è un rischio per la salute umana che indubbiamente richiede una seria ricerca scientifica ed epidemiologica.

 

Per le traduzioni dall’inglese, si ringraziano Claudio Andreini, Viviana Mioranza, Giuditta Fagnani e Valentina Sbrana del Cli.Va.


Allegati:

Clicca qui per leggere e scaricare l’articolo Epidemiologic and Molecular Relationship Between Vaccine Manufacture and Autism Spectrum Disorder Prevalence tradotto in italiano.

Clicca qui per scaricare e leggere il report di Corvelva contenente i risultati delle analisi metagenomiche sui campioni vaccinali.


Rif. bibliografici:

Qin J, Li R, Raes J, et al.: A human gut microbial gene catalogue established by metagenomic sequencing.Nature. Nature Publishing Group; 2010; 464(7285): 59–65

Posada-Cespedes S, Seifert D, Beerenwinkel N. Recent advances in inferring viral diversity from high-throughput sequencing data. Virus Res. 2017 Jul 15;239:17-32. doi: 10.1016/j.virusres.2016.09.016. Epub 2016 Sep 28. Review. PubMed PMID: 27693290.

Cattonaro F, Spadotto A, Radovic S and Marroni F. Do you cov me? Effect of coverage reduction on species identification and genome reconstruction in complex biological matrices by metagenome shotgun high-throughput sequencing [version 1; referees: awaiting peer review]. F1000Research 2018, 7:1767 (https://doi.org/10.12688/f1000research.16804.1)

Morfopoulou S, Mee ET, Connaughton SM, Brown JR, Gilmour K, Chong WK, Duprex WP, Ferguson D, Hubank M, Hutchinson C, Kaliakatsos M, McQuaid S, Paine S, Plagnol V, Ruis C, Virasami A, Zhan H, Jacques TS, Schepelmann S, Qasim W, Breuer J. Deep sequencing reveals persistence of cell-associated mumps vaccine virus in chronic encephalitis. Acta Neuropathol. 2017 Jan;133(1):139-147. doi: 10.1007/s00401-016-1629-y. Epub 2016 Oct 21. PubMed PMID: 27770235; PubMed Central PMCID: PMC5209397.

Deisher TA, Doan NV, Koyama K, Bwabye S. Epidemiologic and Molecular Relationship Between Vaccine Manufacture and Autism Spectrum Disorder Prevalence. Issues Law Med. 2015 Spring;30(1):47-70. PubMed PMID: 26103708.

Jarzyna P, Doan NV, Deisher TA. Insertional mutagenesis and autoimmunity induced disease caused by human fetal and retroviral residual toxins in vaccines. Issues Law Med. 2016 Fall;31(2):221-234. PubMed PMID: 29108182.

Fonte articolo: http://www.onb.it/2018/11/12/la-tecnologia-ngs-applicata-allo-studio-delle-matrici-biologiche-i-vaccini/?fbclid=IwAR34APCp7wuUCs9EmcNS7s_o9N5OPRNxk0gSJ0Y21eiRBsjZJnxMmfNUr58

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